Протеомика в моделировании живой клетки
2010-06-10 11:18На сегодняшний день перед системной биологией стоит важная и сложная задача – моделирование живой клетки, т.е. создание ее динамической модели, учитывающей изменения во времени и в пространстве химического состава клетки, а также особенности протекания всех внутри- и межклеточных биохимических процессов. Особый интерес представляет моделирование клетки, находящейся на разных стадиях жизненного цикла, включая её деление, дифференцировку и гибель.
Изучение клетки с точки зрения системной биологии предполагает наличие у клеточных составляющих приобретенных, так называемых производных, свойств или функций emerging properties). Это означает, что те или иные функции становятся возможными только при достижении определенного уровня сложности организации системы. При этом каждая из составляющих в отдельности может не обладать свойствами (и функциями), которые приобретает система из двух составляющих. А система из двух составляющих может не обладать свойствами и функциями более сложно устроенных систем.
Для динамического моделирования детальных механизмов межмолекулярных взаимодействий и биохимических процессов, происходящих в клетке, все большие возможности предоставляют различные варианты метода молекулярной динамики (МД).
Среди биологических сетей особое место для изучения функционирования клетки занимают молекулярные сети, к которым относятся генные, белковые, метаболические и сигнальные сети. По своим свойствам и принципу организации все эти типы молекулярных сетей относятся к комплексным сетям. Отражая сложность организации биологических систем, они являются объектом исследования системной биологии. Анализ молекулярных сетей позволяет выявлять функциональные модули в них и выяснять роль каждого из компонентов сети в функционировании клетки.
Белковые сети - группы физически взаимодействующих белков, которые функционируют в клетке совместно и скоординированно, контролируя взаимосвязанные процессы, происходящие в организме.
Белки являются основными участниками почти всех клеточных процессов. Поэтому моделирование живой клетки невозможно без всей совокупности данных динамической протеомики, которая изучает изменения концентраций и локализации белков и их взаимодействия друг с другом
Нарушение белок-белковых взаимодействий может приводить к возникновению различных заболеваний, включая опухолевые, нейро-дегенеративные, сердечно-сосудистые, аутоиммунные и др. Поэтому изучение взаимодействующих партнеров и анализ белковых сетей, образованных белок-белковыми взаимодействиями, представляет собой важный инструмент в диагностике заболеваний, выяснении механизма их возникновения и развития, а также эффективности тех или иных терапевтических подходов.
Большинство белков эукариот являются мультимодульными и полифункциональными. Каждый из модулей может выполнять самостоятельную функцию, в результате чего белок приобретает способность выполнять целый комплекс различных функций. В связи с мультимодульностью и полифункциональностью большинства белков эукариот их сложные белковые сети могут переплетаться друг с другом. Потому важным инструментом в моделировании живой клетки является структурно-функциональное картирование белков, позволяющее локализовать их функционально важные участки, в том числе и те, благодаря которым осуществляются белок-белковые взаимодействия.
Интерактомы
Интерактом - вся совокупность белок-белковых взаимодействий, характерная для данного организма.
Количество копий тех или иных белков, приходящихся на одну клетку, может колебаться от нескольких десятков (менее 50) до миллионов. Статистическая оценка возможного размера интерактома человека показала, что он может быть образован примерно 650 тысячами взаимодействий. Определение физически взаимодействующих пар белков позволяет составлять интерактомные карты, которые представляют собой графы, состоящие из узлов, в которых расположен тот или иной белок, и связей между ними, показывающих парные взаимодействия (рис. 1). карты рассматриваются в качестве ключей к получению знаний о функционировании белков в клетках.
Рис. 1. Карта белок-белковых взаимодействий Drosophila melanogaster.
На основании данных, полученных методами in vitro, составляются статические интерактомные карты, анализ которых, как будет показано далее, позволяет описывать динамические белок-белковые взаимодействия, существующие в условиях in vivo. Составление интерактомных карт полезно также и для фундаментальной медицины, а именно для определения роли отдельных белков и их взаимодействий в возникновении и развитии заболеваний, их диагностики, а также возможных мишеней для действия различных лекарств и контролирования эффективности лечения.
Экспериментальными методами в настоящее время определяются взаимодействующие пары белков и белковые комплексы, в основном, у прокариот или простых эукариотических организмов. Для выявления белок-белковых взаимодействий у более сложных организмов, таких как млекопитающие, дополнительно используется метод предсказания их на основании гомологии с белками, взаимодействующие партнеры для которых были выявлены у более простых организмов. Данный подход основан на существовании гомологии между родственными белками и сравнении степени консервативности первичной и пространственной структуры одного и того же белка у разных биологических видов. Например, если экспериментально показано, что два каких-либо белка у дрожжей взаимодействуют друг с другом, то предполагается, что у человека эти белки также взаимодействуют.
Интерологи - две пары белков у разных организмов, эволюционно сохранивших способность взаимодействовать друг с другом.
Использование таких технологий позволяет изучать также действие лекарств на динамику белков в опухолевых клетках, механизм развития резистентности клеток к лекарствам и роль различных белков в выживаемости клеток. Так, изучение динамики около 1200 различных белков в клетках карциномы легких H1299 под воздействием противоопухолевого лекарства камптотецина, блокирующего топоизомеразу-1 в комплексе с ДНК, что сопровождается разрывами ДНК и подавлением транскрипции генов, позволило выявить изменения концентраций и локализации различных белков под влиянием данного лекарства. Клетки интенсивно делились в течение 24 часов с продолжительностью клеточного цикла около 20 часов. Однако уже через 10 часов после добавления лекарства наблюдалось уменьшение подвижности клеток и торможение их деления; начинались морфологические изменения, свидетельствующие о гибели клеток. Спустя 36 часов описанные изменения охватывали 15% всех клеток.
При этом с течением времени почти у 76% белков наблюдались изменения в интенсивности флюоресценции. Группы функционально родственных белков демонстрировали сходную динамику изменений их внутриклеточной локализации и концентраций. Так, например, было показано, что рибосомальные белки подвергались быстрой деградации, в то время как белки цитоскелета и ферменты разрушались относительно медленно. При этом, наиболее медленную деградацию под воздействием лекарства демонстрировали хеликаза и белки, регулирующие апоптоз, такие как Bcl2-ассоциированные белки BAG2 и BAG3, а также PDCD5. Топоизомераза-1 подвергалась быстрой деградации, наиболее существенно изменялась локализация фермента. Концентрация двух белков (а именно, РНК-хеликазы и белка DDX5) значительно увеличивалась в тех клетках, у которых наблюдалась тенденция к выживанию, и уменьшалась в тех, которые претерпевали морфологические изменения, приводящие к их гибели.
Таким образом, было показано, что различия в реакции клеток на воздействие лекарства определяются различиями в изменениях концентрации и локализации тех или иных белков. Огромным достоинством подобных методов микроскопии является возможность изучать процессы, происходящие в условиях живой клетки с сохранением естественных функций внутриклеточных макромолекул. Кроме того, они позволяют наблюдать процессы, происходящие в одной, отдельно взятой, клетке в режиме реального времени.
Компьютерное исследование белковых комплексов требует применения высокоэффективных вычислительных методов и разработки новых алгоритмов, таких как MCL (Markov Clustering), RNSC (Restricted Neighborhood Search Clustering), SPC (Super Paramagnetic Clustering), MCODE (Molecular Complex Detection). В последнее время достигнут значительный прогресс в широкомасштабном картировании интерактомов различных организмов, а также в создании баз данных и специальных инструментов для анализа информации, хранящейся в них.
Базы данных
Современные базы данных содержат информацию о сотнях тысяч взаимодействий, образованных несколькими тысячами белков у десятков биологических видов. Так, например, база данных BioGRID (Biological General Repository for Interaction Datasets) в настоящее время содержит информацию примерно о 198 тысячах взаимодействий для шести биологических видов. Такие базы данных содержат информацию о взаимодействующих парах белков, полученных либо с помощью экспериментальных методов, либо определенных на основании гомологии между аминокислотными последовательностями, либо предсказанных с использованием компьютерных методов. Целью таких баз данных, как DIP (Database of Interacting Proteins), BIND (Biomolecular Interaction Network Database) и INTERACT является интегрирование огромного количества экспериментальных данных, обеспечение легкого доступа к ним и возможности их визуализации. Базы данных также снабжены инструментами для оценки достоверности экспериментально полученных результатов. Они широко используются для конструирования и анализа белковых сетей, составляющих основу функционирования живой клетки.
Создаваемые в настоящее время базы данных не только содержат информацию о взаимодействующих партнерах, но также позволяют производить детальный структурный анализ участков, ответственных за взаимодействие. Например, база данных SCOWLP (Structural Characterization Of Water, Ligands and Proteins) содержит информацию об аминокислотных остатках и группах атомов, участвующих во взаимодействиях. Благодаря этому она обеспечивает осуществление детального анализа взаимодействий между белками, доменами и пептидными мотивами разных белков, а также их взаимодействий с растворителем. Другим примером является глобальная интерактомная карта PSIMAP (Protein Structural Interactome Map), построенная с использованием данных о домен-доменных взаимодействиях с участием всех белков, для которых экспериментально установлена пространственная (3D) структура, представленная в базе данных PDB (Protein Data Bank). С помощью алгоритма PSIMAP можно рассчитать эвклидовы расстояния между аминокислотными остатками двух взаимодействующих доменов в составе разных белков. Два домена считаются взаимодействующими, если, по крайней мере, пять аминокислотных остатков находятся на расстоянии менее 5Å (правило 5–5). Данный алгоритм позволяет осуществлять предсказание взаимодействующих партнеров на основании гомологии первичных аминокислотных последовательностей белков и их структурных доменов. Информация о взаимодействующих партнерах содержится в базе данных PSIbase.
Методы изучения белок-белковых взаимодействий
1.Дрожжевой двугибридный анализ (Y2H – yeast two-hybrid assays)
2.Фаговый дисплей
3.Аффинная очистка в тандеме с масс-спектрометрией (TAP-MS – tandem affinity purification-mass spectrometry)
4.Микроскопия
5.Математические и компьютерные методы
|